HCP ELISA方法學驗證——精密度與重復性(Precision & Reproducibility)
當我們已經驗證過HCP ELISA與樣品基質的兼容性,并且找到了樣品的最低需求稀釋度(MRD)后,那么下一步就是驗證ELISA方法的精密度,進而完成法規要求的ELISA方法學驗證的全部流程。 什么是精密度和重復性? 精密度是指多次檢測結果之間的一致性程度,通常以實驗的重復性進行評估,以變異系數(%CV)來表示。 計算公式:%CV=(標準差/平均濃度)×100% 通過此公式,可以評估兩種精密度: 批內精密度:衡量單次實驗內不同復孔之間的重復性。嚴格的批內CV表明樣品讀數不受加樣位置或操作程序的影響。 批間精密度:衡量多次獨立實驗之間的重復性。確保批間CV在可接受范圍內(通常<15-20%,取決于法規要求)是證明該方法能持續穩定產出可靠結果的關鍵指標。 法規要求 ? ICH Q2(R1) 方法:在3個濃度水平下至少進行9次測定,覆蓋該測定的分析范圍(在3個濃度下進行3次重復) 標準:未說明。 ? US FDA 方法:至少在3個濃度水平下進行5次測定,覆蓋該測定的分析范圍(在3個濃度下進行5次重復) 標準:每個濃度水平下精密度的CV%應在±20%范圍內,LLOQ的CV%不應超過25%。 ? EMA 方法:在4種濃度下至少進行5次測定(在LLOQ、LLOQ的三倍以內、標準曲線濃度的30-50%、ULOQ的至少75%,4種濃度下進行5次重復)。 標準:每一濃度水平質控的批內和批間精密度均不應超過15%,LLOQ的CV%不應超過20%。 常見問題排查:導致CV值偏高的原因 如果實驗結果的CV值高于試劑盒說明書中的預期范圍,那么很可能是操作流程或設備出現了問題,我們建議您按以下步驟進行問題排查與實驗優化。 洗板操作 問題原因: 過度劇烈的洗板是CV值異常偏高的常見原因,包括使用自動洗板機、用力拍板等操作,因其可能導致抗原-抗體復合物發生非特異性解離,進而造成CV值過高。 優化建議: 為實現最佳重復性,我們強烈推薦洗瓶洗板法,可以通過交替方向加入洗液來確保每個孔的清洗時間保持基本一致。有關洗板的詳細操作請參考下文。
如何用正確的洗板方法解決ELISA檢測結果漂移的問題? 酶標儀性能 問題原因: 當在低吸光度范圍(如OD值<0.1)的檢測值出現較大波動時,可能提示酶標儀存在潛在問題。光源、單色器或濾光片的故障可能導致間歇性信號異常或噪聲,此類問題通常無法通過常規校準程序識別,但會對檢測的靈敏度以及定量限(LOQ)和檢測限(LOD)產生顯著影響。該類問題常表現為在空白孔或僅含有非吸附性液體的孔中,孔與孔之間OD值讀數標準偏差達到0.020或更低。 優化建議: 對于HRP-TMB顯色的ELISA,推薦使用雙波長讀數(如檢測波長450nm,參比波長650nm)。通過雙波長讀數法,可從檢測波長(如450nm)處的信號值中扣除非特異性信號(如650nm處的背景OD值),從而提高檢測結果的準確性與可靠性。該方法可以最大限度地減少因污漬或塑料缺陷引起的孔間差異,從而提升精密度與準確度。 (注:質量良好的板條在參比波長(如650nm)的OD值通常很低(平均約0.040),且孔間OD值標準差極小(約0.002)。若實際檢測OD值遠高于0.040且標準差大于0.004,則表明酶標儀可能存在問題。) 試劑污染 問題原因: Cygnus的ELISA試劑盒靈敏度高達pg/mL至ng/mL級別,實驗室環境中潛在的高濃度分析物(如培養基、上游工藝樣品中的HCP或BSA,濃度可達mg/mL級),非常容易對試劑盒中的關鍵組分造成污染,如果檢測結果出現孔板中個別孔吸光值偏差過大,且同一個試劑盒重復后偏差數據值相似,則可能是孔板的孔、標準品或酶標抗體出現了污染。 優化建議: 盡可能在遠離處理上游樣品的區域內進行ELISA實驗操作,避免交叉使用移液器,做好操作臺面與儀器的清潔,盡可能使用帶有濾芯的吸頭等。 分析人員與儀器 問題原因: 操作不規范,移液器未校準或使用質量不達標的吸頭,均可能對檢測結果的精密度產生不利影響。 優化建議: 邀請另一位分析人員在獨立實驗室中使用不同設備進行平行測試,可能有助于您確定精密度不理想的原因是由于操作人員缺乏經驗,還是常規實驗室工具存在問題,比如移液器未校準或吸頭質量差。 成功完成ELISA方法的精密度與重復性驗證,是確保數據可靠、推動項目前進的基石。Cygnus針對每一種檢測試劑盒均提供相應的QS(Qualification Summary)文件,如有需求歡迎點擊這里填寫信息索取,或直接聯系Cygnus中國總代理西美杰。如您在使用Cygnus HCP ELISA試劑盒的過程中遇到任何問題,我們的技術支持團隊將竭誠為您提供解決方案和建議。 Cygnus Technologies專注為生物技術和生物制藥行業提供產品和分析方法超過25年,旨在加速研發階段和提高產品質量。Cygnus開發和生產的生物工藝殘留試劑盒,用于檢測超過50種不同表達系統的特異性雜質。Cygnus作為專注于生物技術應用免疫檢測的高靈敏度分析技術的專家,其產品和服務已經被全球超過95%以上生物制藥公司使用,并獲得FDA、NMPA、EMA等監管機構的廣泛認可。 北京西美杰科技有限公司作為Cygnus在中國總代理,與國內眾多知名藥企,CRO/CMO企業建立了長久穩定的合作關系。多年來西美杰的產品及服務幫助許多企業加速R&D階段,提高藥物質量、純度和安全,加速優化研發工藝,減少產品上市時間,降低QC成本。如您對上述產品感興趣,歡迎致電西美杰客服熱線400-050-4006或者登陸網站www_xmjsci_com.dndestatesales.com了解更多信息。
更多>